BABII
TINJAUAN PUSTAKA
Protein adalah makromolekul yang
secara fisik dan fungsional kompleks yang melakukan beragam peran penting.
Untuk meneliti sifat-sifat fisik dan fungsional suatu protein secara rinci,
diperlukan protein yang sangat murni. Sel mengandung ribuan protein yang
berlainan, masing-masing dengan jumlah yang sangat bervariasi. Untuk memisahkan
masing-masing protein dari campuran kompleks sering digunakan pelarut atau
elektrolit (atau keduanya) untuk mengeluarkan fraksi protein yang berbeda
sesuai karakteristik kelarutannya. Hal
ini adalah dasar dari sesuatu yang disebut sebagai metode salting-out, yang
digunakan dalam penentuan fraksi protein di laboratorium klinik. Oleh karena
itu, kita dapat memisahkan protein plasma menjadi tiga kelompok besar
–fibrinogen, albumin, dan globulin berdasarkan pemakaian natrium atau amonium
sulfat dengan berbagai konsentrasi.
Metode yang paling sering digunakan
untuk menentukan kemurnian suatu protein adalah SDS-PAGE-elektroforesis gel
poliakrilamid (polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) dengan menggunakan
deterjen anionik natrium dodesil sulfat (sodium dodecyl sulfate, SDS).
Elektroforesis memisahkan biomolekul-biomolekul bermuatan berdasarkan laju
migrasi biomolekul tersebut dalam medan listrik. Pada SDS-PAGE, akrilamid
mengalami polimerisasi dan pengikatan silang untuk menghasilkan matriks
berpori. SDS mendenaturasi dan mengikat protein dengan perbandingan satu
molekul SDS per dua ikatan peptida. Jika digunakan bersama 2-merkaptoetanol
atau ditiotreitol untuk mereduksi dan memutus ikatan disulfida, SDS memisahkan
komponen polipeptida dari protein multimerik. Jumlah molekul SDS anionik yang
besar, masing-masing bermuatan -1, di masing-masing polipeptida mengalahkan
muatan yang ditimbulkan oleh gugus fungsional asam amino. Karena perbandingan
muatan terhadap massa masing-masing kompleks SDS-polipeptida kira-kira sama,
resistensi fisik yang dijumpai masing-masing peptida sewaktu bergerak melintasi
matriks akrilamid menentukan laju migrasi. Karena kompleks besar menemui
resistensi yang lebih besar, polipeptida-polipeptida akan terpisah berdasarkan
massa molekul relatif polipeptida tersebut. Setiap polipeptida yang
terperangkap dalam gel akrilamid divisualisasikan dengan pulasan zat pewarna,
seperti Coomassie blue.
Reaksi berantai polimerase
(Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu metode enzimatis untuk
melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu dengan
cara in vitro. Metode ini pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary
B. Mullis seorang peneliti di perusahaan CETUS Corporation.
Metode ini sekarang telah
banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analisis genetik.
Pada awal perkembangannya metode ini hanya digunakan untuk
melipatgandakan molekul DNA, tetapi kemudian dikembangkan lebih lanjut sehingga
dapat digunakan pula untuk melipatgandakan dan melakukan kuantitasi molekul
mRNA (Yuwono, 2006).
Polymerase Chain Reaction (PCR)
adalah cara in vitro untuk memperbanyak target sekuen spesifik AN untuk
analisis cepat atau karakterisasi, walaupun material yang digunakan pada awal
pemeriksaan sangat sedikit. Pada dasarnya PCR meliputi tiga perlakuan
yaitu:denaturisasi, hibridisasi dari "primer" sekuen DNA pada bagian
tertentu yang diinginkan, diikuti dengan perbanyakan bagian tersebut oleh Tag
polymerase; dikerjakan dengan mengadakan campuran reaksi dalam tabung mikro
yang kemudian diletakkan pada blok pemanas yang telah diprogram pada seri
temperatur yang diinginkan (Prijanto, 1992)
Siklus PCR diawali oleh denaturasi
pada suhu 94°C yang berfungsi untuk mengubah DNA untai ganda menjadi untai
tunggal. Selanjutnya adalah tahap annealing (penempelan) yaitu pengikatan
primer pada DNA untaitunggal yang dilakukan pada suhu 50°C. Akhir dari proses
amplifikasi ini adalah polimerisasi (pemanjangan rantai) pada suhu 72°C. Pada
tahap polimerisasi diperlukan primer, buffer, enzim DNA polimerase, dan dNTPs
untuk pemanjangan rantai (Gumilar, dkk., 2008).
Penggunaan dNTP sebagai building
blocks berfungsi untuk menyediakan sumber basa nukleotida yang akan digunakan
pada polimerisasi. Ada 4 macam dNTP dimana sesuai dengan basa penyusun DNA,
yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP. Buffer PCR terdiri atas Tris-HCl, KCl dan
Triton X-100 berfungsi untuk mengkondisikan reaksi PCR agar berjalan optimum
danmenstabilkan enzim DNA polimerase. Ion logam yang digunakan berfungsi
sebagai kofaktor enzim polimerase sehingga dapat bekerja optimal.
BAB IV
HASIL DAN
PEMBAHASAN
 |
| 1. uji latex |
 |
| 2. Hasil PCR menggunakan primer dan sample DNA |
Dapat
dilihat pada uji latex yang kita lakukan hanya isolat 1 pada kolam ke-6 yang
mengalami koagulasi dan ini menunjukkan isolat 12 positif , Hasil uji positif
ini meneguhkan bahwa isolat yang diuji
100% merupakan isolat E.coli
O157. Identifikasi ini mengacu
pada prosedur pabrik (Oxoid), yang menyatakan bahwa uji lateks
E. coliO157 merupakan uji yang
sangat akurat dengan tingkat sensitivitas 100% sertatingkat spesifisitas 99%
(Anonim, 1998). Dari uji ini kita dapat melanjutkan kepada uji PCR yang dimana pada
praktikum ini kita menggunakan isolat 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12
kondisi PCR yang digunakan heat lid 110.0⁰C dengan Siklus PCR yang diawali oleh denaturasi pada
suhu 94°C selama 1 menit yang berfungsi
untuk mengubah DNA untai ganda menjadi untai tunggal. Selanjutnya adalah tahap
annealing (penempelan) yaitu pengikatan primer pada DNA untai tunggal yang dilakukan
pada suhu 64°C selama 30 menit. Akhir dari proses amplifikasi ini adalah
polimerisasi (pemanjangan rantai) pada suhu 72°C selama 1 menit.
Uji PCR ini menggunakan primer gyrB
(UP1S dan UP2Sr) ini merupakan primer universal untuk amplifikasi , dengan
1205bp penambahan DreamTaq Green PCR
Master Mix , kemudian dilanjutkan dengan penambahan dH2O sebagai
pelarut dan didapatkan hasil isolat 1,4
dan 10. Pada isolat lain tidak terdeteksi hal ini bisa disebabkan oleh
kesalahan pada proses isolasi DNA.
Komponen-komponen
yang dibutuhkan dalam PCR antara lain templat DNA, primer, buffer, MgCl2,
Taq polymerase, ddNTPs, ddH2O. Templat DNA merupakan supernatan
hasil lisis sel yang berisi DNA yang ingin diamplifikasi. Primer disusun dari
sintesis oligonukleotida sepanjang 15-32 bp dan mampu mengenali urutan yang
akan diamplifikasi. Standar sepasang primer untuk amplifikasi mempunyai kisaran
pasangan basa sekitar 20 basa panjangnya pada tiap primernya. Kandungan basa
guanin dan sitosin berada diantara 45-60%.
DAFTAR PUSTAKA
http://a-research.upi.edu/operator/upload/s_d0451_0611035_chapter2%281%29.pdf, Diakses 29
mei 2014
.
0 komentar:
Post a Comment